יתר לחץ דם ממאיר והכליה: ישן וחדש

יתר לחץ דם ממאיר והכליה: ישן וחדש
ד"ר שי אפרתי1, סילביה ברמן1, Msc, פרופ’ יהושע ויסגרטן2 - 1המכון הנפרולוגי והיחידה למחקר, מרכז רפואי אסף הרופא, צריפין 2מנהל מכון נפרולוגיה ויל"ד, מרכז רפואי אסף הרופא, צריפין


תקציר
יתר לחץ דם ממאיר גורם נזק כליתי חריף אשר יכול להתפתח לאי ספיקה כלייתית כרונית. מבחינה אנטומית הנזק הינו לתאי האפיתל, האנדותל והמזנגיום, עם התפתחות של נמק פיברינואידי ובסוף סקלרוזיס גלובלי. בתרביות תאים שבהן נבדק אפקט הלחץ הישיר, נמצא כי הלחץ מורגש בעיקר ע"י תאי המזנגיום אשר כתוצאה מכך מפרישים אנגיוטנסין 2 מקומית. העלייה ברמות האינגיוטנסין 2 מביאה לאפופטוזיס ופרוליפרציה בתאי המזנגיום, האפיתל והאנדותל. האפופטוזיס במקרה זה אינו מתווך ע"י הגן p53. בניגוד לכך תוספת גלוקוז למדיום גורמת לעלייה באפופטוזיס דרך הפעלת הגן p53 ללא קשר ללחץ ההידרוסטטי.
יל"ד ממאיר הוא תסמונת הכוללת עליית לחץ דם דיאסטולי מעל 140 עם פגיעה בכלי דם ברשתית הכוללת דימומים, אקסודטים ובצקת פטמה.
מצב זה גורם, אם לא יטופל, לתמותה של 50% תוך חצי שנה. 80% מתים תוך שנה. עם טיפול תרופתי הפרוגנוזה היום היא 75% חיים אחרי 5 שנים.
הפתופיזיולוגיה כוללת בעיקר פרוליפרציה מיו-אינטימלית ונמק פיברינואידי בכלי הדם. עיבוי המדיה והאינטימה גורמים להיצרות הלומן וצורה של קליפות בצל של כלי הדם. ניתן גם לראות ספזם של כלי דם, כתוצאה מאוטו-רגולציה עם וזודילטציה מקומית כתוצאה ממתיחת יתר.
תחילה נגרם נזק לאנדותל ואחר כך מתחילה כניסת פיברין לחלל האינטרצלולרי עם בצקת, השקעת פיברין ויצירת טרומבוס. היצרות כלי הדם הנוצרת תורמת לאיסכמיה של האברים.
יל"ד מואץ מתפתח הן עקב עליית לחץ הדם עצמו והן עקב מעורבות הורמונלית בתהליך, המחמירה את המצב. עליית רמת רנין ואלדוסטרון נצפית במרבית המקרים. הפרשת היתר של הרנין קשורה לשינויים הווסקולריים בכליה, ועליית רמת אנגיוטנסין 2 מחמירה הלאה וזוקונסטריקציה ואיסכמיה כלייתית, המעלה הלאה את הפרשת הרנין. תהליך של "נטריאורזיס מלחץ" מחמיר את הקטנת נפח הדם וגם זה מעלה את הפרשת הרנין.
אי ספיקה כלייתית כרונית מתפתחת בתהליך זה עקב הפרוליפרציה המיו-אינטימלית בכלי הדם בכליה, הגורמת בהמשך איבוד נפרונים. במצב זה הורדת לחץ הדם יכולה לגרום נפילה נוספת בפינוי הכלייתי בצורה חדה. אבל בהמשך, הורדה טיפולית של לחץ הדם יכולה לגרום חזרה לכיוון הנורמלי של השינויים של נמק פיברינואידי (תוך שבועות) ושל התעבות המדיה (שבועות עד חודשים) ולעתים, במספר מקרים, אף שיפור של התפקוד הכלייתי.
המכניזם שדרכו לחץ הדם גורם אי ספיקה כלייתית מתקדמת הוא יתר לחץ דם גלומרולרי.
בתחילה עולה קצב הזרימה הקפילרית המעלה את הלחץ ההידרוסטטי: יל"ד סיסטמי הוא גורם ראשוני לכך. הלחץ הסיסטמי הגבוה מועבר לתוך הגלומרולוס מכיוון שההתנגדות העורקית האפרנטית אינה עולה בהתאם. הלחץ הגבוה יותר (לזרימה מהירה יותר) גורם נזק לתאים הגלומרולריים ולסקלרוזיס פרוגרסיבית.

יל"ד גלומרולרי גורם נזק לתאים כדלקמן:

1. נזק אנדותליאלי - עקב שחרור חומרים וזואקטיביים, השקעת ליפידים בכלי הדם, טרומבוזיס בקפילרות
2. נזק למזנגיום - הצטברות מאקרומולקולות, עלייה בייצור מטריקס, עלייה בריבוי תאים
3. נזק אפיתליאלי - פרוטאינוריה, ירידה בפרמאביליות למים

השינויים האנטומיים בכליה

עם התקדמות לחץ הדם מתחיל להיות תמט של הגלומרולוס, דופנות הקפילרות מתעבות. בהמשך נוצר נפרוסקלרוזיס, בתחילה סגמנטלית ואחר כך גלובלית.
התמט של הקפילרות כולל קיפולים של הממברנה הבזאלית באזור פרמזנגיאלי, עם עיבוי המטריקס המזנגיאלי הגורמים יחד לחסימת החלל הקפילרי, איבוד תאי אנדותל והשקעת חומר דמוי ממברנה בזאלית.



בהמשך ההתכווצויות של הקפילרות והסקלרוזיס ההיאלינית של הקפסולה של באומן מתאחדים לחומר הרוס, והתוצאה:סקלרוזיס גלובלית.
גם הטובולים נעשים אטרופיים עקב האיסכמיה עם ריבוי קולגן אינטרסטיציאלי.
השינויים בגלומרולוס ביל"ד ממאיר מראים שינויים מעבר לאלו הנגרמים ע"י יל"ד "רגיל". הנמק הפיברינואידי בעורקים האפונטים פולש לתוך הגלומרולוס, ואז אפשר לראות נמק פוקלי בגלומרולוס.
ייתכנו טרומבוזיס של הקפילרות והתרבות תאים גלומרולריים. לעתים נוצרים סהרונים עם הידבקויות לקפסולות באומן. ה-JGA מוגדל והיפר פלסטי.
מידת הפרוטאינוריה משקפת את מידת הנזק האפיתליאלי, ומנבאת את קצב ההידרדרות של אי הספיקה הכלייתית. גורמים נוספים המעורבים בהידרדרות המחלה הכלייתית עקב יל"ד:
- רטציה של נתרן
- הפעלת ציר רנין-אנגיוטנסין-אלדוסטרון
- הפעלת מערכת סימפתטית
- ירידה ב-NO, ייתכן שעקב עלייה ב-ADMA
- הפעלת צירים הורמונאליים, כגון עמידות לאינסולין, קורטיזול,
הורמון הפאראתירואיד ושאר מתווכים של העקה החמצונית
- אריטרופויטין חיצוני
כאמור לעיל, הפעלת הציר רנין-אנגיוטנסין בכליה היא הרסנית במיוחד בנושא זה. רמות אנגיוטנסין 2 בכליה במצב זה גבוהות עד פי אלף מהרמה בדם. באופן נורמלי עליית לחץ הדם הייתה אמורה להוריד רמת הרנין במנגנון היזון חוז, אך במצב של יל"ד ממאיר המנגנון של אוטורגולציה נשבר ומערכת הרנין-אנגיוטנסין מוגברת מאוד ללא דיכוי קומפנסטורי. ברמה התאית, לא ברור בכליה אלו תאים נפגעים ראשונים ואלו תאים נפגעים אחר כך.
מבנה הקפילרה הגלומרולרית מיוחד מאוד. רוב החלל הקפילרי מוגבל על ידי תאי אנדותל, אך חלק מחלל זה מגודר על ידי תאי מזנגיום. תאי האנדותל "יושבים" על כל ממברנה בזאלית, ואילו תאי המזנגיום באזור זה הם ללא ממברנה כזו (תמונה 1).
נוסף על כך, תאי המזנגיום הם בעלי יכולת ייחודית להתכווץ ולהתפשט: יש בתוכם סיבי שריר חלק, וכך הם מסוגלים להגיב ללחץ ובכך לשנות את שטח הפילטרציה הגלומרולרית ולשנות את קצה הפילטרציה הגלומרולרית. בצורה זו תאי המזנגיום יכולים להגיב ללחץ הסיסטמי המועבר לגל ומרולים, ולמתן את השפעתו. באופן נורמלי הלחץ המועבר לתוך הגלומרולים הוא פחות מ-50% מהלחץ הסיסטמי, כך שהן האנדותל והן האפיתל חשופים באופן נורמלי ללחצים נמוכים. במצב של יל"ד ממאיר היכולת הרגולטורית של המזנגיום נפגעת והתאים הגלומרולריים חשופים ללחץ הסיסטמי המלא, דבר שגורם לנזק הכלייתי במצב זה.
האפקט הישיר של לחץ הידרוסטטי כזה על תאים נפרדים מעולם לא נבדק. במספר עבודות שפרסמנו (Journal of Hypertension 2009;27:365-375 Journal of Hypertension, 2007;25:1041-1052) בדקנו השפעה ישירה כזו בתרבית תאים. בשלב ראשון בדקנו השפעה של ייצור ורמת אנגיוטנסין 2, פרוליפרציה, אפופטוזיס וביטוי הגן p53.



לצורך הניסויים פותח במיוחד תא לחץ לתרביות התאים. זה אמבט מים עם גוף חימום המצוי בתא לחץ קטן, והמים מחוממים ל-37 מעלות. לחץ האוויר נשמר סביב 160 ממ"כ, לאחר שסדרת ניסויים בלחצים שונים הראתה שזה הלחץ האופטימלי להשגת התוצאות, מה גם שהוא מקביל ללחץ הסיסטמי הממוצע באדם. האוויר המכיל 20% חמצן ו5%- פחמן דו-חמצני מוזרם בקביעות בקצב של 0.5 ליטר לדקה לשמירת הלחץ המוגדר (תמונה 2).
בניסוי בדקנו את עיקר התאים הקיימים בגלומרולוס-אנדותל, אפיתל ומזנגיום.
תאי המזנגיום בודדו מגלומרלים קורטיקליים של עכברים מסוג p57b וכן מזן שהוא Knockout לגן p53, ונשמרו במדיום ספציפי. מקור לתאי האפיתל שימש Cell Line אפיתליאלי כלייתי מסוג KNRK שנרכש מבנק התאים האמריקאי, ומקור התאים האנדותליאליים היה Cell Line של תאי וריד אומביליקלי הומני.
כל התאים הושמו בבקבוקי תרבית רקמה בשכבה בודדת ונחשפו לסדרת לחצים של 80, 120, 150, 160, 180 ממ"כ למשך חצי שעה, שעה ושעתיים במכשיר הלחץ שפותח. התוצאות האופטימליות ושדמו ליתר התוצאות היו לאחר שעה בלחץ 160 ממ"כ ובתנאים אלה ביצענו את הניסוי כולו.

קבוצות הניסוי היו כדלקמן:
תאים בלחץ 160 ממ"כ לא כל תוספת
תוספת של אנגיוטנסין 2 בריכוז של 10 בחזקת 8-
תוספת לוסרטן בריכוז 10 בחזקת 6-
תוספת PD123319 בריכוז 10 בחזקת 6- (חוסם AT2 רצפטור)
תוספת סרלזין בריכוז 10 בחזקת 6-
תוספת נוגדן לאנגיוטנסין 2 בריכוז 10 בחזקת 8-
תוספת קפטופריל בריכוז 10 בחזקת 6-
בוצעו ניסויים פרה-לימינריים של עקומת מינון-תגובה כדי לאמת את הריכוזים האופטימליים שבהם השתמשנו.
נוסף על כך, לאחר הפעלת לחץ במשך 24 שעות, המדיום מתרביות המנזגיום בלבד וכן המדיום מתרביות המזנגיום עם האנגיוטנסין נאסף והושם על תאי אנדותל או אפיתל טריים שלא עברו טיפול בלחץ, למשך 48 שעות.
לאחר כל הניסויים נשטפו התאים ונזרעו על זכוכיות נושא עגולות מיוחדות בצלחות תרביות רקמה, והושמו באינקובטור תרביות רקמה למשך 48 שעות. אחר כך בוצעו הבדיקות הבאות:
1. בדיקת התרבות התאים - אינקורפורציה של תימידין
2. בדיקת מידת אפופטוזיס בשיטת Tunel וצביעת Mayer
3. בדיקת התבטאות הגן p53 בשיטת Western Blot
4. בדיקת רמת אנגיוטנסין 2 במדיום בשיטת RIA
5. בדיקת רמת Pro Metalloproteinase 1-1pmm - בשיטת ELIZA
6. בדיקת Reactive Oxygen Species נעשתה על ידי בדיקת
Hydrogen Peroxide בשיטה פוטוקולורימטרית


תוצאות Pro Metalloproteinase 1-1pmm - בשיטת ELIZA

רמת אנגיוטנסין 2 (תמונה 3)
הפעלת הלחץ בלבד על תאי המזנגיום גרמה עלייה ניכרת ברמת אנגיוטנסין 2 במדיום. תוספת קפטופריל למדיום לפני הניסוי מנעה לחלוטין עלייה זו של אנגיוטנסין 2.
תרביות המזנגיום מעכברים ללא הגן ל-p53 הראו הפרשה בסיסית גבוהה יותר של אנגיוטנסין 2 שעלתה הלאה עם הפעלת הלחץ. עלייה זו דוכאה גם היא על ידי קפטופריל. לא תאי האפיתל ולא תאי האנדותל הראו כל הפרשה בסיסית של אנגיוטנסין 2 וכן לא הייתה בתרביות אלה כל עלייה ברמת אנגיוטנסין עם הפעלת הלחץ.
התרבות התאים
הפעלת הלחץ גרמה עלייה ברורה בהתרבות תאי המזנגיום. אנגיוטנסין 2, עם או בלי הלחץ, העלה את מידת ההתרבות. תוספת לוסרטן או סרלזין מנעה את העלייה בהתרבות בכל הניסוי. ל-pd123319 לא הייתה כל השפעה בניסוי זה. גם תוספת לוסרטן או נוגדן לאנגיוטנסין 2 מנעו את העלייה בהתרבות. בתאי מזנגיום ללא הגן p53 נמצאה התרבות מוגברת במצב הבסיסי שהוגברה הלאה בעקבות הפעלת הלחץ.
לעומת כל הנ"ל, הפעלת הלחץ על תאי אנדותל או אפיתל לא גרמה כל עלייה בהתרבות התאים, בשעה שתוספת
אנגיוטנסין 2 כן גרמה עלייה בהתרבותם, שנמנעה לחלוטין על ידי תוספת לוסרטן, ונמנעה חלקית ע"י תוספת pd123319.
התרבות תאי אפיתל או אנדותל טריים שלא עברו טיפול בלחץ, אך הוסף להם מדיום מתאי מזגיום שכן עברו טיפול בלחץ, הייתה מוגברת.



אפופטוזיס
בתאי המזנגיום שנחשפו ללחץ הייתה אפופטוזיס מוגברת משמעותית, גם בהשוואה לתאים שלהם הוסף
אנגיוטנסין 2. שילוב של הלחץ ואנגיוטנסין 2 גרם עלייה נוספת במידת האפופטוזיס. גם כאן תוספת לוסרטן מנעה את הגברת האפופטוזיס ואילו תוספת pd123319 הייתה ללא השפעה. גם תוספת קפטופריל או נוגדנים לאנגיוטנסין מנעה את העלייה באפופטוזיס. מידת האפופטוזיס הבסיסית בעכברים שהם Knockout לגן p53 הייתה מוגברת, עם עלייה ברורה לאחר הטיפול בלחץ.
תאי האנדותל והאפיתל לא הגיבו בעליית מידת האפופטוזיס בתגובה ללחץ. תוספת אנגיוטנסין 2 לתאי האפיתל, אך לא לתאי האנדותל, גרמה לעלייה באפופטוזיס, ללא קשר לטיפול בלחץ. תוספת לוסרטן, סרלזין ונוגדנים לאנגיוטנסין הפחיתו את האפופטוזיס שנגרם על ידי אנגיוטנסין 2. גם כאן ל-pd123319 לא הייתה כל השפעה.
לתאי האפיתל שהודגרו עם מדיום תאי מזנגיום ששהו בלחץ הייתה עלייה ברורה במידת האפופטוזיס, ללא קשר לטיפול עם אנגיוטנסין 2.
התבטאות הגן 53p
בכל הניסיונות שתוארו לעיל לא הייתה כלל הפעלה של הגן p53. זה נכון לכל סוגי התרביות של תאי המזנגיום, אנדותל ואפיתל.
רמת proMMP1
הרמה הבסיסית כאן הייתה גבוהה בתאי האנדותל לעומת תאי האפיטל או המזנגיום. הפעלת הלחץ, עם או בלי תוספת אנגיוטנסין 2, לא גרמה לכל שנוי ברמת המטלופרואינזה. גם תוספת כל החסמים של ציר הרנין-אנגיוטנסין לא שינתה דבר.
ייצור Hydrogen Peroxide
לא הייתה כל עלייה בתגובה ללחץ. כך גם לא הייתה כל השפעה של חסמי הציר רנין-אנגיוטנסין. המצב היה זהה בכל
התרביות - מזנגיום, אפיתל, אנדותל.
אם נסכם תוצאות ביניים אלה, הפעלת לחץ הידרוססטי על תאי מזנגיום גרמה עלייה בייצור אנגיוטנסין 2, התרבות התאים ומידת האפופטוזיס. תוספת אנגיוטנסין 2 הייתה סינרגיסטית, והעלתה הלאה את כל הפרמטרים האלה. לעומת זאת, לא היה כל אפקט של לחץ הידרוסטטי או תוספת אנגיוטנסין 2 בתאי אפיתל או אנדותל לגבי ניסויים אלה. אנגיוטנסין 2 או מדיום של תאי מזנגיום המכיל כמויות רבות של אנגיוטנסין 2 גרמו לאפופטוזיס והתרבות תאי אפיתל ולא תאי אנדותל, ללא תלות בלחץ ההידרוסטטי.
יל"ד ממאיר, עם ממוצע אופייני של ל"ד ממוצע סביב 160, גורם נזק ברור לאברי המטרה. התסמונת הקלינית כוללת אנצפלותפיה, רטינופתיה עם בצקת פטמה, וכן נזק לרקמת הכליה, הנוצר לאחר איבוד אקוטי של היכולת האוטורגולטורית. מכיון שהכליה נתונה בתוך קפסולה ריגידית יחסית, הכוח המזיק הוא פשוט לחץ הידרוסטטי גבוה. האפקט הספציפי של הלחץ ההידרוסטטי המפעיל ישירות את ציר הרנין-אנגיוטנסין במרכיבי רקמת הכליה השונים מתואר לראשונה במחקר זה. ידוע היטב שחלקים שונים של ציר הרנין-אנגיוטנסין קיימים בתאי מזנגיום, אפיתל ואנדותל. אנזים ה-ACE, למשל, קיים בכל התאים האלה, וכך גם אנגיוטנסין 2, AT1+AT2 רצפטורים. גם הרנין, פרו רנין והרצפטור שלהם קיימים על תאי המזנגיום ותאי השריר החלק הווסקולרי בכליה. התוצאות שהוצגו מוכיחות את תפקיד המזנגיום בנזק הנגרם ביל"ד ממאיר. מתברר מניסויים אלה שאנגיוטנסין 2 הנוצר בתאי המזנגיום עקב הלחץ, הוא האחראי להתרבות ולאפופטוזיס של התאים. כל צורת עיכוב של אנגיוטנסין 2 מנעה את הנזק. ניתן היה להוכיח כי האנגיוטנסין 2 גורם לנזק דרך הרצפטור AT1. ייתכנו אפשרויות אחרות לדרך שגורם אנגיוטנסין 2, כמו כניסתו לתוך התא שלא דרך הרצפטורים האפייניים שלו והשפעתו בתוך התא, אינה תלויה ברצפטורים אלה. חשובה ביותר כאן ההוכחה שהאנגיוטנסין ממקור מזגיאלי הוא הגורם לנזק האנדותליאלי והאפיתליאלי במצב זה ולא הלחץ ההידרוסטטי ישירות. האם קשורה לכך העובדה שלא נמצא רנין או הרצפטור שלו בתאי האנדותל? שכן כל יתר מרכיבי הציר קיימים בתאים אלה. כלומר, בתנאי הניסוי, רק תאי המזנגיום המכילים רנין יכלו לייצר אנגיוטנסין 2 בתגובה ללחץ.
אנגיוטנסין 2 ידוע ביכולתו לייצר אפופטוזיס מוגברת בתאי אנדותל, וכן גורם להם לייצר TNF-α מטלופרוטאינזות ו-VEGF. במחקר זה לא ראינו עלייה בפרומטלופרוטאינזה 1 בכל מצב ניסויי. ייתכן שדרוש לכך יותר זמן משעה אחת, בעבודות אחרות היה צורך ב-24 שעות לשם כך. במקביל גם העקה החמצונית לא נמצאה מוגברת בניסויים אלה. ניתן לסכם נתונים אלה ולומר שלא עקה חמצונית ולא מטלופרוטאינזות תורמים לנזק הרקמתי עקב יל"ד ממאיר אקוטי. בתאי שריר לב מבוגרים הפעלת ציר הרנין-אנגיוטנסין וייצור אנגיוטנסין 2 בחיה השלמה תלויים בהפעלת הגן p53 שתוצרו קשור למעגל חלוקת התא ואיראי לאפופטוזיס. עודף אנגיוטנסין 2 בלב מאקטב את הגן p53, ויוצר מנגנון היזון חוזר חיובי בין אנגיוטנסין 2 ובין הגן. מכיוון שתאי המזנגיום הם בעלי סיבי שריר ומוצאם מיוגני, חשבנו שמנגנון כזה קיים גם בתאי המזנגיום. לא מצאנו בתאי המזנגיום כל קשר בין הלחץ ההדרוסטטי לאנגיוטנסין 2 ולהפעלת הגן p53, בניגוד מוחלט ללב. גם תאים מחיה שהיא Knockout לגן p53 יצרה אנגיוטנסין 2 והגיבה בפרוליפרציה ואפופטוזיס ללחץ הידרוסטטי גבוה. ניתן לסכם נושא זה ולומר שבתאי המזנגיום אין לגן p53 כל תפקידבייצור אנגיוטנסין 2 וגרימת פרוליפרציה ואפופטוזיס, בניגוד גמור לשריר הלב.
ניתן לסכם כללית שבמודל ייחודי זה של יל"ד ממאיר, תאי המזנגיום בכליה מגיבים בלעדית ללחץ, מייצרים אנגיוטנסין 2, הגורם לפרוליפרציה ולאפופטוזיס. הפעלת המזנגיום בצורה זו היא הגורמת לנזק בתאי האפיתל והאנדותל, והפעלה זו לא קשורה לגן p53.
בניסוי הבא רצינו לבדוק את הקשר בין רמת גלוקוז גבוהה במדיום במודל הנ"ל.
רמת איזון נמוכה של הגלוקוז בחולים וחיות סוכרתיות גורם נזק כלייתי ומקדם אותו. יל"ד הוא אחד הגורמים העיקריים התומך ומקדם נזק כלייתי בנפרופתיה סוכרתית. אין מידע רב על הקשר של יל"ד ממאיר לסוכרת. היפרגליקמיה ידועה כגורמת עלייה בעקה החמצונית בכליה, עלייה באפופטוזיס התלויה בקספזה, וכן מפעילה את ציר הרנין-אנגיוטנסין בתרבית תאי כליה. בחיה שלמה, הפעלת הציר התוך-כלייתי מלווה ייצור יתר של אנגיוטנסין 2. במצב ייצור יתר זה יש הגברה ניכרת של הלחץ התוך-גלומרולרי והגברת לחץ הפרפוזיה בגלומרולוס. שילוב של גלוקוז גבוה בכליה עם עלייה באנגיוטנסין 2 גורם להיפרצלולריות, הגברת אפופטוזיס, השקעת חומר בין-תאי - כולם מחמירים את הנזק לרקמת הכליה.
ביצענו את כל הניסויים שתוארו בתחילת המאמר עם גלוקוז בכמות 25 ממול\ליטר ובלעדיו, לחיקוי ההיפרגלקמיה in vivo.

אפופטוזיס
בתרבית עם הגלוקוז גברה האפופטוזיס משמעותית. זה קרה גם בתאי מזנגיום, גם באנדותל וגם באפיתל. חסימת ציר
הרנין-אנגיוטנסין לא שינתה את התמונה. בהפעלת הלחץ של התאים במדיום עם גלוקוז גבוה האפופטוזיס גברה בצורה ניכרת בכל סוגי התאים במידה זהה ללא הלחץ. כלומר, לתוספת הלחץ לא היה אפקט משמעותי. גם כאן העיכובים השונים של ציר הרנין-אנגיוטנסין לא שינו דבר.
התרבות
רמת גלוקוז גבוהה במדיום גרמה נטייה לירידה ביכולת ההתרבות של התאים מכל הסוגים. גם כאן הפעלת הלחץ לא שינתה דבר וההתרבות הייתה ירודה יותר, ללא שינוי עם הפעלת הלחץ ובלי הפעלת הלחץ.
p53
הגלוקוז גרם הפעלת p53 בכל סוגי התאים. תוספת הפעלת הלחץ לא שינתה דבר על פרמטר זה. גם כאן עיכוב ציר הרנין-אנגיוטנסין היה ללא כל השפעה על הגן p53.
בניסוי אחר בדקנו את השפעת עיכוב p53 על האפופטוזיס של תאי המזנגיום והאנדותל. כל התרביות ה"סוכרתיות" הדגימו ירידה בגן p53 לאחר טיפול ב-Pifithrin, שהוא המעכב הספציפי של ייצור ה-p53. בכל התרביות תוספת מעכב זה דיכאה באופן ניכר את האפופטוזיס, ללא קשר אם הופעל לחץ או שלא הופעל לחץ.
עקה חמצונית
העלייה בעקה החמצונית, כפי שהתבטאה בעלייה ב-Hydrogen Peroxide, הייתה סיגניפקנטית בהשפעת הגלוקוז הגבוה. זה קרה בכל סוגי התאים: מזנגיום, אנדותל ואפיתל. הפעלת הלחץ לא שינתה משמעותית גורם זה.
ייצור אנגיוטנסין 2
בכל התאים שנחשפו למדיום עם סוכר גבוה הייתה עלייה ברורה בייצור אנגיוטנסין 2. חסימת ציר הרנין-אנגיוטנסין לא חסמה כלל את העלייה בייצור האנגיוטנסין 2 במצב זה. הפעלת הלחץ העלתה הלאה את ייצור האנגיוטנסין 2 במזנגיום בלבד ולא באנדותל או באפיתל כאשר עלייה זו נחסמה על ידי קפטופריל.
לסיכום, הממצא העיקרי הוא שללא קשר להפעלת הלחץ ההידרוסטטי, הדגרת התאים במדיום רב סוכר גרמה הפעלת הגן p53, וכן ללא קשר ללחץ, הגברת האפופטוזיס ועלייה בייצור אנגיוטנסין 2. הגברת האפופטוזיס הייתה קשורה בעלייה בעקה החמצונית.
נפרופתיה סוכרתית מלווה בהגברת פעילות הציר רנין-אנגיוטנסין, המוגברת ע"י הגלוקוז עצמו בין השאר. בניסוי זה מתן קפטופריל עדיין לא דיכא במלואו את ייצור האנגיוטנסין 2 בתאים עם מדיה רבת סוכר. ייתכן שזה קשור לרמות גבוהות מאוד של האנזים ACE, או של התבטאות AT1R, המוגברים בריכוז גבוה של גלוקוז. תוצאות אלה יכולות לתמוך בהיגיון שבנפרופתיה סוכרתית יש לטפל בשילוב של ACEi עם ARB.
בניגוד לממצאים הקודמים, עם לחץ גבוה וללא גלוקוז במדיום, שלגן p53 לא היה כל קשר למערכת, הרי שבמצב של גלוקוז גבוה יש הפעלה ברורה של הגן הגוררת אפופטוזיס מוגברת, עקה חמצונית גבוהה וייצור יתר של אנגיוטנסין 2. עיכוב ספציפי של ייצור ה-p53 מנע את הפעלת כל הגורמים האלה.
יוצא שבכל מקרה להפעלת הלחץ הגבוה אין השפעה על התבטאות הגן p53 בכל רמה של סוכר במדיום. הגן הופעל ספציפית על ידי רמות גלוקוז גבוהות.
in vivo, הפעלת הגן p53 הודגמה בחיות סוכרתיות, במקביל אפופטוזיס מוגברת בתאי כליה ואחרים. האפופטוזיס הזו בכליה נמצאה כקשורה לפודוציטופתיה, פרוטאינוריה ולסקלרוזיס גלומרולרית. הגברת אפופטוזיס קשורה בדרך כלל לעלייה בפרוליפרציה. בניסויים אלה עם רמת גלוקוז גבוהה לא הייתה עלייה בפרוליפרציה. ברמה התאית, עלייה אקוטית בגלוקוז מעלה פרוליפרציה מיידית, אך מדוכאת תוך 24 שעות.
הקשר בין p53 ובין הפעלת הציר רנין-אנגיוטנסין הוא מסובך. לפרומוטר של הגן של אנגיוטנסינוגן ושל AT1R יש קשים לגן p53. במיוציטים בלב יש קשר הדוק בין הפעלת p53 ובין ייצור אנגיוטנסין 2. עיכוב בייצור p53 גורם להפחתה בייצור אנגיוטנסין 2. בניסוי זה הדגמנו את הקשר בין הפעלת הגן p53 בנזק התאי הכלייתי הנגרם על ידי גלוקוז. האפופטוזיס המוגברת כאן לא לוותה בעלייה בפרוליפרציה, האמורה הייתה להחזיר תאים נורמליים בחזרה.
יוצא שבשני המודלים של הגברת אפופטוזיס, קרי לחץ גבוה מול גלוקוז גבוה, מכניזם ההופעה שונה לגמרי: בלחץ גבוה הגורם הוא ייצור אנגיוטנסין 2 ע"י תאי מזנגיום, ללא תלות ב-p53, בשעה שהאפקט של גלוקוז גבוה תלוי בגן p53 בכל התאים, לא רק במזנגיום, ולא קשור ללחץ, והוא זה שגרם עלייה באנגיוטנסין 2.
ניתן לסכם שרמות גלוקוז גבוהות משנות את תגובת התאים ללחץ. המכנזים של התוצאה הסופית של אפופוטוזיס מוגברת שונה בהתאם לגירוי: לחץ גבוה פועל דרך אנגיוטנסין 2 המיוצר במזנגיום, ואילו רמות סוכר גבוהות עובדות דרך p53.


LeftSide